Der standardisierte Nachweis für Schimmelpilze erfolgt üblicherweise über die Kultivierung der aus der Luft gesammelten Sporen auf Nährmedien. Die Sporen wachsen innerhalb mehrerer Tage zu Kolonien aus, die mit bloßem Auge gezählt werden können. Mit diesen kulturellen Methoden werden jedoch nur lebende, vermehrungsfähige Schimmelpilze nachgewiesen.
Schimmelpilzsporen zeichnen sich durch verdickte Zellwände aus, die sie sehr widerstandsfähig gegen UV-Strahlung, mechanische Einwirkungen und mikrobiellen Angriff machen. Gegen Trockenheit sind die Sporen vieler Schimmelpilze jedoch nur mäßig gut geschützt. In Innenräumen freigesetzte Schimmelpilze werden nicht so schnell abgebaut, wie dies in der Natur der Fall ist. Die trockene Raumluft erlaubt keine biologischen und chemischen Umsetzungsprozesse. Sporen und Zellbruchstücke können sich daher im Hausstaub von Wohnräumen, die von Schimmel befallen sind, sehr stark anreichern. Dies kann selbst dann der Fall sein, wenn die betroffenen Wohnräume regelmäßig gereinigt werden.
Hausstäube, die an unzugänglichen Stellen wie auf oder hinter Heizkörpern, Schrankwänden oder Wandverkleidungen abgelagert wurden, können beispielsweise während der Raumreinigung oder bei Durchzug wieder aufgewirbelt werden. Untersuchungen über die Höhe der Luftbelastung in Innenräumen müssen daher in Ergänzung zu kulturellen Methoden immer auch mikroskopische Nachweistechniken beinhalten.
Herausforderungen bei der Schimmelpilzdiagnostik und die Rolle der Mikroskopie
Nur selten ist ein Schimmelpilzbefall anhand seiner dunklen Färbung sichtbar. Häufiger als gedacht gibt es Schimmelpilzbefall mit transparentem Pilzmyzel, das im Tageslicht unsichtbar ist. Hier bietet die Dunkelfeldmikroskopie, insbesondere in Verbindung mit Fluoreszenzbildanalyse, neue Möglichkeiten.
Durch Fluoreszenzbildanalyse im kurz- und mittelwelligen Bereich werden auch unsichtbare Schimmelpilze sichtbar, sofern die Betrachtung durch Spezialfilter erfolgt, die genau auf die Wellenlängen des Anregungslichtes abgestimmt sind. Die Hyphenstruktur tritt im Fluoreszenzbild deutlich hervor, wodurch Verwechslungen mit mineralischen Ausblühungen oder Verschmutzungen ausgeschlossen werden können. Im Fluoreszenzbild wird durch farbliche Differenzierung auch erkennbar, wo unterschiedliche Pilzarten lokalisiert sind. Dies ist eine große Hilfe bei der Probenahme für weiterführende Untersuchungen.
Sogar mit Wandfarbe überstrichener Schimmelpilzbefall wird bei Betrachtung mit der richtigen Kombination von Erregerlicht und Filter erkennbar.
Im Bereich der Innenraumhygiene werden mikroskopische Methoden zur Beurteilung der Raumluft- und Oberflächenbelastung eingesetzt. Eine besonders große Bedeutung bei der Gefährdungsbeurteilung kommt der mikroskopischen Untersuchung des Aktivitätszustandes und der Sporendichte der Pilzkolonien zu. Zur Anwendung kommen dabei innovative Färbe- und Nachweistechniken für Sporen und Zellbruchstücke.
Das Prinzip der Dunkelfeldmikroskopie
Die Dunkelfeldmikroskopie ist eine seit über 250 Jahren bekannte Variante der Lichtmikroskopie. Sie erzeugt einen dunklen Bildhintergrund, vor dem sich die zu beobachtenden Strukturen hell abheben. Dadurch können von durchsichtigen Objekten mit nur sehr geringem Kontrast dennoch gut aufgelöste, kontrastreiche Bilder erzeugt werden, ohne dass eine vorherige Färbung des Präparats erforderlich ist. Auch lebende Objekte sind gut beobachtbar.
Bis zur Entwicklung der Phasenkontrastmikroskopie in den 1930er Jahren war die Dunkelfeldmikroskopie neben der ähnlichen Kontrastfarben- („Rheinberg“)-Beleuchtung und der schiefen Beleuchtung die einzige Methode zur Kontrastverstärkung bei ungefärbten Präparaten.
Das Prinzip der Dunkelfeldmikroskopie beruht darauf, dass Objekte Licht nicht nur absorbieren, sondern auch immer einen Teil des Lichtstrahls ablenken. Wenn die Beleuchtung so eingestellt ist, dass die direkten Lichtstrahlen am Objektiv des Mikroskops vorbeigehen, sieht der Betrachter nur das abgelenkte Licht. Eine der Ablenkungsursachen ist die als Tyndall-Effekt bezeichnete Streuung von Licht an kleinen Teilchen. Auch Teilchen, die kleiner sind als die Auflösungsgrenze des Mikroskops, lenken Licht ab und lassen sich daher mit einem Dunkelfeldmikroskop nachweisen. Manche Eigenschaften wie die Beweglichkeit von Teilchen lassen sich so untersuchen.
Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie
Bei der Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie wird das Präparat von der Rückseite so beleuchtet, dass die Beleuchtung nicht direkt in das Objektiv gelangt, sondern nur das im Präparat abgelenkte Licht. Der Hintergrund des Bildes erscheint somit dunkel, während Objekte im Präparat hell erscheinen. Dies funktioniert auch und besonders bei weitgehend transparenten Proben. Während die Helligkeitsunterschiede des abgelenkten Lichts wegen der hohen Lichtintensität der Hellfeldabbildung schwer zu erkennen sind, erscheinen diese Unterschiede in der Dunkelfeldabbildung deutlich stärker.
Um die Dunkelfeldbeleuchtung zu erzeugen, gibt es verschiedene Methoden:
- Zentralblende: Eine einfache Methode, bei der die Kondensorblende eng geschlossen und seitlich verschoben wird, bis kein direktes Licht mehr in das Objektiv eindringt. Dies erzeugt eine Beleuchtung von einer Seite.
- Spezielle Dunkelfeldkondensoren: Diese erzielen durch Spiegeltechniken eine höhere Lichtausbeute und können durch Immersion (Öl oder Wasser zwischen Kondensor und Objektträger) auch den Anforderungen höher vergrößernder Objektive gerecht werden. Moderne Dunkelfeldkondensoren sind oft Kardioidkondensoren, bei denen ein konvex gewölbter zentraler Spiegel das eintreffende Licht nach außen auf einen konkaven Spiegel lenkt, der den Kegelmantel erzeugt.
Für eine erfolgreiche Dunkelfeldbeleuchtung muss die numerische Apertur des Kondensors höher sein als die des verwendeten Objektivs. Dies stellt sicher, dass das abgelenkte Licht vom Objektiv eingefangen wird, während das direkte Licht vorbeigeht.
Auflicht-Dunkelfeldmikroskopie
Bei der Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung fällt das Licht von der Objektivseite auf das Präparat. Glatte, stark reflektierende Flächen erscheinen dunkel, während Kanten und Oberflächendefekte wie Kratzer oder Auflagerungen hell aufleuchten und somit leichter erkannt werden können. Bei rauen, wenig reflektierenden Oberflächen sorgt die seitliche Anordnung der Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung für lokale Schattenbildung, wodurch Oberflächenstrukturen plastischer wirken.
Abgrenzung zur Dunkelfeldanalyse von Blut
Die Dunkelfeldmikroskopie wird manchmal auch für die Analyse von Blutproben unter dem Namen „Vitalblutanalyse“ oder „Dunkelfeldmikroskopie nach Enderlein“ beworben. Diese Methode geht davon aus, dass sich anhand von Blutbildern der Gesundheitszustand beurteilen lässt und Hinweise auf Krankheiten wie Krebs geben kann.
Wissenschaftliche Belege für die Verlässlichkeit dieser Diagnoseverfahren im Bereich der Blutuntersuchung konnten jedoch nicht gefunden werden. Studien zeigten, dass die Dunkelfeldanalyse von Blutproben oft keine zuverlässigen Ergebnisse liefert und die Treffsicherheit bei der Erkennung von Krankheiten wie Krebs gering ist. Zudem führte die Methode häufig zu unterschiedlichen Ergebnissen, wenn Blutproben derselben Person zweimal hintereinander untersucht wurden, was eine Grundvoraussetzung für Diagnoseverfahren verletzt.
Es ist wichtig zu betonen, dass die Dunkelfeldmikroskopie ein wertvolles Werkzeug in der biologischen und materialwissenschaftlichen Forschung ist, insbesondere zur Untersuchung von transparenten Proben oder zur Hervorhebung von Strukturen. Ihre Anwendung zur medizinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs oder Mangelerscheinungen im Blut ist wissenschaftlich nicht belegt und wird kritisch betrachtet.
Dunkelfeld Mikroskopie leicht erklärt
tags: #dunkelfeldmikroskopie #schimmelpilz #saugling